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    ELISA測定的常用模式--固相捕獲法測IgM抗體

    發(fā)布時(shí)間: 2010-01-25  點(diǎn)擊次數(shù): 2535次

    在病原體急性感染的診斷中,通常需檢測IgM抗體,如急性甲型肝炎診斷的血清抗HAVIgM檢測、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM檢測和TORCH項(xiàng)目的系列IgM檢測等。IgM抗體也有使用間接法測定的,如目前在市場上可見到的有些TORCH系列的IgM檢測試劑盒。在使用間接法測IgM抗體時(shí),由于臨床血清樣本中含有高濃度的IgG抗體,其中部分特異IgG抗體將與IgM抗體競爭與固相抗原結(jié)合,從而干擾IgM抗體的檢測。

     
        因此,在使用間接法測定IgM抗體時(shí),通常須將血清樣本用抗人IgG抗體或SPA預(yù)處理,以去除IgG的干擾。這樣不但測定較為繁瑣,而且影響測定的特異性和靈敏度。目前,常用的IgM抗體檢測方法為捕獲法,即以抗人IgM抗體(抗人u鏈)作為固相抗體,當(dāng)加入血清標(biāo)本時(shí),其中的IgM類抗體(特異的和非特異的)即可被固相抗體捕獲,再加入特異抗原,其與固相上捕獲的IgM抗體結(jié)合后,加入酶標(biāo)抗特異抗原的抗體,zui后加入底物顯色。具體操作步驟如下:
     
        1.首先將抗人IgMbt鏈抗體于碳酸鹽緩沖液中40c下過夜包被聚苯乙烯等固相,形成固相抗體,洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗體后,用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉,洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。
        2.加入含待測IgM抗體的臨床樣本如血清等,溫育一定時(shí)間后洗板;此時(shí),待測樣本中的IgM抗體就會與固相上的抗P鏈抗體反應(yīng)而吸附于固相上。
        3.加入特異的抗原如HAV抗原、HBcAg等,溫育一定時(shí)間后洗板;此時(shí),特異抗原就會與固相上的特異IgM抗體發(fā)生反應(yīng)。
        4.加入酶標(biāo)記的抗特異抗原的抗體,溫育一定時(shí)間后洗板;此時(shí),在固相上即形成相應(yīng)的抗原抗體復(fù)合物。
        5.加入酶底物,溫育顯色測定(圖2—10)。
     
     
        本方法要著重注意的是RF(1gM類)及其他非特異IgM的干擾。RF(1gM類)由于其能與固相抗人u鏈抗體結(jié)合,并可與隨后加入的酶標(biāo)抗體(動物IgG)反應(yīng),從而導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。而非特異IgM由于其在*步溫育中,可與特異IgM競爭與固相抗體結(jié)合,所以會影響測定的靈敏度。因此,使用本法測IgM,必須對臨床樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋。樣本稀釋后,上述產(chǎn)生干擾作用的非特異IgM含量減少,而特異IgM由于處于相應(yīng)病原體的急性感染期,滴度很高,一定稀釋后,不會有明顯影響,況且,在某些病原體如HBV的慢性感染階段,IgM類特異抗體也能持續(xù)存在,只不過滴度要低很多。
     
        因此,如不對血清樣本稀釋,就直接檢測,即使是沒有非特異IgM的干擾,陽性測定結(jié)果也沒有急性感染的診斷價(jià)值?,F(xiàn)在,有些試劑生產(chǎn)廠家,為了迎合臨床實(shí)驗(yàn)室減輕勞動強(qiáng)度、簡便操作的要求,生產(chǎn)了不需對樣本進(jìn)行稀釋的抗HAVIgM和抗HBclgMELISA試劑盒,現(xiàn)有不少實(shí)驗(yàn)室也在使用。鑒于上面提到的原因,我們建議臨床實(shí)驗(yàn)室在做抗HAVIgM和抗HBc lgM等類檢測時(shí),應(yīng)使用對樣本進(jìn)行稀釋的試劑盒,以保證檢測的臨床價(jià)值。
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